1. G418 स्क्रीनिंग 293T कोशिकाओं का कार्य सिद्धांत
G418 एक नियोमाइसिन एंटीबायोटिक है जो इंट्रासेल्युलर प्रोटीन के संश्लेषण में हस्तक्षेप करता है, जिससे कोशिका मृत्यु होती है। हालाँकि, नियोमाइसिन प्रतिरोध जीन वाली कोशिकाएं G418 की विषाक्तता का विरोध करने के लिए प्रतिरोधी प्रोटीन का उत्पादन कर सकती हैं। इसलिए, G418 युक्त संवर्धन माध्यम में, केवल नियोमाइसिन प्रतिरोध जीन वाली कोशिकाएं ही जीवित रह सकती हैं और विकसित हो सकती हैं।
2. 293T कोशिकाओं पर G418 सांद्रता का प्रभाव
293T कोशिकाओं पर G418 सांद्रता का प्रभाव बहुआयामी है, जिसमें कोशिका वृद्धि, कोशिका व्यवहार्यता, कोशिका आकृति विज्ञान और कोशिका प्रतिरोध शामिल है। 293T कोशिकाओं पर G418 सांद्रता के विशिष्ट प्रभाव मुख्य रूप से निम्नलिखित पहलुओं में प्रकट होते हैं:
1. कोशिका वृद्धि: कम G418 सांद्रता (जैसे कि {{2%).25 mg/ml) पर, 293T कोशिकाएँ सामान्य रूप से विकसित हो सकती हैं, कोशिका घनत्व धीरे-धीरे बढ़ता है, और आकृति विज्ञान अच्छा रहता है। G418 सांद्रता (जैसे कि 0.5 mg/ml) की वृद्धि के साथ, कोशिका वृद्धि दर धीमी होने लगती है और कोशिका घनत्व धीरे-धीरे बढ़ता है। जब G418 सांद्रता 1 mg/ml तक पहुँच जाती है, तो कुछ कोशिकाएँ मरने लगती हैं और कोशिका घनत्व काफी कम हो जाता है। G418 सांद्रता (जैसे 2 mg/ml) में वृद्धि जारी रखने पर, कोशिका मृत्यु अधिक गंभीर होती है और कोशिका घनत्व कम हो जाता है। 2. सेल व्यवहार्यता: G418 सांद्रता जितनी अधिक होगी, सेल व्यवहार्यता उतनी ही कम होगी। G418 (जैसे कि {{15%).25 mg/ml) की कम सांद्रता पर, कोशिका व्यवहार्यता अधिक होती है, कोशिका आकृति विज्ञान पूर्ण होता है, और धुंधलापन एक समान होता है। जैसे-जैसे G418 की सांद्रता बढ़ती है, कोशिका व्यवहार्यता धीरे-धीरे कम हो जाती है, कोशिका आकृति विज्ञान अनियमित हो जाता है, और धुंधलापन असमान हो जाता है। G418 (जैसे 2 mg/ml) की उच्च सांद्रता पर, कोशिका व्यवहार्यता कम होती है, कोशिका आकृति विज्ञान गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो जाता है, और धुंधलापन असामान्य होता है।
3. कोशिका आकृति विज्ञान: G418 की सांद्रता जितनी अधिक होगी, कोशिका आकृति विज्ञान उतना ही अधिक अनियमित होगा। G418 की कम सांद्रता पर, कोशिका आकृति विज्ञान मोटा, धुरी के आकार का या सपाट होता है। जैसे-जैसे G418 की सांद्रता बढ़ती है, कोशिका आकृति विज्ञान अनियमित हो जाता है, कोशिका का आयतन सिकुड़ जाता है, और कोशिका के किनारे अस्पष्ट हो जाते हैं। G418 की उच्च सांद्रता पर, कोशिका आकृति विज्ञान गंभीर रूप से क्षतिग्रस्त हो जाता है, कोशिका शरीर बेहद छोटा हो जाता है, और कोशिका के किनारे टूट जाते हैं।
4. सेल प्रतिरोध: G418 की सांद्रता जितनी अधिक होगी, सेल प्रतिरोध उतना ही मजबूत होगा। G418 की कम सांद्रता पर, कोशिकाएँ G418 के प्रति अधिक संवेदनशील होती हैं और कोशिका मृत्यु का खतरा होता है। जैसे-जैसे G418 की सांद्रता बढ़ती है, कोशिकाओं में धीरे-धीरे प्रतिरोध विकसित होता है और कोशिका के जीवित रहने की दर बढ़ जाती है। G418 की उच्च सांद्रता पर, कोशिका प्रतिरोध अपने चरम पर पहुँच जाता है, और कोशिकाएँ G418 की उच्च सांद्रता की विषाक्तता का विरोध करने में सक्षम होती हैं।
इसलिए, 293T कोशिकाओं के लिए, G418 की स्क्रीनिंग सांद्रता आमतौर पर 1-2 mg/ml के बीच होती है। इस सांद्रता को प्रायोगिक आवश्यकताओं के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। सामान्यतया, स्क्रीनिंग सांद्रता जितनी अधिक होगी, स्क्रीनिंग प्रभाव उतना ही बेहतर होगा, लेकिन इससे कोशिकाओं को कुछ नुकसान भी होगा। इसलिए, स्क्रीनिंग एकाग्रता चुनते समय, प्रयोगात्मक उद्देश्य और सेल सहनशीलता को तौलना आवश्यक है। वास्तविक ऑपरेशन में, आप कम सांद्रता से शुरू कर सकते हैं, जैसे कि 0.5 मिलीग्राम/एमएल, कोशिका वृद्धि का निरीक्षण करें, और धीरे-धीरे एकाग्रता बढ़ाएं जब तक कि आपको उपयुक्त स्क्रीनिंग एकाग्रता न मिल जाए।